浙江工商大学顾青教授团队在植物乳杆菌ZJ

在植物乳杆菌ZJ可减弱幽门螺杆菌诱导的C57BL/6小鼠胃炎

——浙江工商大学食品与生物工程学院顾青教授团队

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近日，浙江工商大学食品与生物工程学院顾青教授团队在国际期刊《JournalofAgriculturalandFoodChemistry》在线发表题为“LactobacillusplantarumZJAttenuatesHelicobacterpylori-InducedGastritisinC57BL/6Mice"的研究论文。周青青为一作，顾青教授、郦萍研究员为通讯作者，浙江工商大学食品与生物工程学院为第一完成单位。

●研究背景

幽门螺杆菌感染被认为是严重胃肠疾病的主要原因，包括慢性胃炎、胃溃疡和胃癌。这种感染的流行率在工业化国家约为30-50%，在发展中国家高达80%。自年以来，幽门螺杆菌被国际癌症研究机构和世界卫生组织(IARC/WHO)列为1类致癌物。目前的治疗方法，如双重治疗[质子泵抑制剂(PPI)和阿莫西林]，三联治疗(PPI、克拉霉素和阿莫西林/甲硝唑)，而以铋为基础的四联疗法，主要依靠抗生素。抗菌药物使用后，耐药幽门螺杆菌持续增长，治疗根除率下降。大量研究表明，世卫组织地区对克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星的耐药率≥15%，美洲和东南亚地区对克拉霉素的耐药率为10%，欧洲地区对左氧氟沙星的耐药率为11%。研究表明，由于梭状芽孢杆菌种类和一些肠道沙门氏菌血清型的增加，抗生素会导致胃肠道微生物紊乱。抗生素相关性腹泻可在口服抗生素后数小时至2个月发生，发生率为5-25%。与传统疗法不同的是，具有天然、有效药物和少数副作用的非抗生素疗法已成为一种有前景的选择。

由于高酸度和胃中频繁的消化运动，以前认为胃微生物的数量非常有限。益生菌是一种具有活性和耐酸性的微生物，在胃中的存活时间比任何其他细菌都长。益生菌可以在人体胃肠道中定居，并通过调节免疫系统、平衡胃肠道菌群和促进营养吸收来影响宿主健康。近年来，使用益生菌保护胃肠道感染已越来越多地被证明是抗生素的替代物，因为益生菌具有减少抗生素副作用的潜力。乳酸菌(LAB)通常被认为是安全的(GRAS)，并已在临床试验中广泛用于治疗和预防幽门螺杆菌。大量体外和体内研究表明，LAB菌株，如约翰逊乳杆菌La1、干酪乳杆菌Shirota、罗伊乳杆菌DSM、唾液乳杆菌UCC、鼠李糖乳杆菌GG和加氏乳杆菌OLL，对幽门螺杆菌感染具有拮抗作用。当作为三联疗法的佐剂给药时，益生菌增加了幽门螺杆菌的根除率，同时减少了副作用。类似地，当作为预防幽门螺杆菌感染的预防措施给药时，益生菌可减少幽门螺杆菌负荷并平衡胃微生物群。此外，长期摄入含乳酸菌的产品可能对人体幽门螺杆菌感染具有有价值的辅助作用，从而降低与胃炎症相关的疾病的风险。益生菌如鼠李糖乳杆菌GG可降低幽门螺杆菌诱导的胃肠疾病的严重性，但不能完全根除幽门螺杆菌。

研究假设益生菌通过多种机制抑制体内幽门螺杆菌。LAB可以通过与胃上皮细胞和胃粘蛋白结合来干扰幽门螺杆菌与胃上皮细胞的相互作用，从而导致胃肠道粘膜表面的竞争性定殖，并成为生理屏障的一部分。因此，具有较强自聚集和共聚集能力的LAB可以阻碍幽门螺杆菌在胃定殖。由LAB产生的代谢物，如抗菌肽、有机酸、胞外多糖(EPSs)和短链脂肪酸(SCFAs)，参与针对幽门螺杆菌的粘膜免疫应答。LAB还可诱导连续的细胞和体液免疫，从而刺激或抑制与免疫应答相关的促炎和抗炎细胞因子的产生，如IL-10、IL-6、IFN-γ、IL-1β、TNF-α和TLR4。已有研究发现由丁酸梭菌产生的丁酸可以通过抑制促炎因子TNF-α和IL-1β的过表达来调节核因子κB途径，并可以间接阻碍作为幽门螺杆菌主要毒力因子的细胞空泡毒素VacA的毒性作用。此外，参与宿主免疫系统的生理形成和体内平衡的胃微生物群在胃病中起着重要作用。定期摄入乳酸菌可选择性地促进有益微生物的生长并抑制有害微生物种群，包括属于幽门螺杆菌科、巴氏杆菌科和丹毒属等的微生物种群。

1.对模拟胃肠道环境的耐受性

图2植物乳杆菌ZJ和鼠李糖乳杆菌GG在模拟胃肠环境中的耐受性。(A)植物乳杆菌ZJ和鼠李糖乳杆菌GG暴露于模拟胃液(pH2.0和3.0)2小时和4小时后的存活率；(B)植物乳杆菌ZJ和鼠李糖乳杆菌GG暴露于胆盐(0.3和0.5%)2小时和4小时后的存活率。

图2显示了植物乳杆菌ZJ和鼠李糖乳杆菌GG在暴露于模拟胃液(pH2.0和3.0)和胆盐(0.3%和0.5%)后的存活率。随着胃液酸碱度的降低，植物乳杆菌ZJ和鼠李糖乳杆菌GG的存活率显著降低(图2A)。在pH3.0的模拟胃液中，植物乳杆菌ZJ和鼠李糖乳杆菌GG的2h存活率分别为86.70±1.60%和83.40±0.60%；在pH2.0时，上述菌株在2h的存活率分别为52.70±1.00%和45.30±2.10%；在胆汁耐受方面，植物乳杆菌ZJ在0.3%胆盐中的2h存活率超过79%，而其4h存活率为70.30±1.50%。当胆盐浓度增加到0.5%时，植物乳杆菌ZJ的存活率在2h为60.70±2.08%，4h为49.70±3.51%。在相同条件下，用0.3%和0.5%胆盐处理的鼠李糖乳杆菌的存活率比植物乳杆菌ZJ低约8%(p0.05)。总的来说，在模拟胃肠环境中，植物乳杆菌ZJ在4h内保持了比鼠李糖乳杆菌GG更好的生存能力。

2.乳酸菌的自聚集和共聚集能力

图3自动聚集和共聚集速率。(A)植物乳杆菌ZJ/鼠李糖乳杆菌GG的自聚集率。(B)植物乳杆菌ZJ/鼠李糖乳杆菌GG和幽门螺杆菌ZJC03的共聚集率。

如图3所示，对两种乳杆菌的自聚集和共聚集能力进行了48小时的评估。植物乳杆菌ZJ的初始自聚集率为11.76±1.73%；鼠李糖乳杆菌自聚率为82.18±0.61%，植物乳杆菌ZJ自聚率从7.24±2.03%显著提高到68.18±0.67%，比鼠李糖乳杆菌自聚率(49.27±1.75%)高20%左右(p0.)这些结果表明，植物乳杆菌ZJ对胃肠环境具有长期的积极影响。

3.幽门螺杆菌脲酶活性抑制率

表2幽门螺杆菌与乳酸菌共培养的脲酶活性

幽门螺杆菌产生的脲酶被认为是胃炎和消化性溃疡的主要病因。使用分光光度计测量LAB的抗脲酶活性，以评估在nm处产生的颜色的吸光度。如表2所示，在植物乳杆菌ZJ和鼠李糖乳杆菌GG存在下，1h后幽门螺杆菌的初始吸光度分别从1.39±0.11变为0.47±0.05和0.45±0.05；相应的抗脲酶活性率分别为67.47%2.36%和64.49%4.49%。植物乳杆菌ZJ和鼠李糖乳杆菌GG在这方面没有显著的统计学差异。

4.乳酸菌的体外抗幽门螺杆菌活性

表3乳酸菌对幽门螺杆菌ZJC03的抗菌活性

图4用SEM和TEM观察了37℃下植物乳杆菌ZJ和鼠李糖乳杆菌GG处理10h后幽门螺杆菌ZJC03的形态变化。扫描电镜(SEM)观察包括(A)到(E)，透射电镜(TEM)观察包括(A’)到(E’)。(A,A’)未经处理的幽门螺杆菌ZJC03细胞。(B,B’)植物乳杆菌ZJ的细胞。(C,C’)用植物乳杆菌ZJ处理幽门螺杆菌ZJC03细胞。(D,D’)鼠李糖酵母菌GG细胞。(E,E’)幽门螺杆菌ZJC03细胞经鼠李糖酵母菌GG处理后。

植物乳杆菌ZJ和鼠李糖乳杆菌GG对幽门螺杆菌的抗菌活性用琼脂孔扩散法进行评估，如表3所示。植物乳杆菌ZJ活细胞比鼠李糖乳杆菌GG活细胞具有更强的抗幽门螺杆菌活性(抑制带分别为14.82±0.28mm和12.47±0.28mm)(p0.05)。3.8和4.6的MRS(空白对照)没有抗幽门螺杆菌活性。

用扫描电镜和透射电镜观察了在37℃下暴露于植物乳杆菌ZJ和鼠李糖乳杆菌GG活细胞10小时的幽门螺杆菌细胞的形态学变化。通过扫描电镜观察，未处理的幽门螺杆菌细胞具有完整的形态，带有轻微弯曲的杆或短弧(图4A)。植物乳杆菌ZJ和鼠李糖乳杆菌GG细胞具有完整的杆状形态(图4B，D)。经植物乳杆菌ZJ处理后，大部分幽门螺杆菌细胞结构不完整或消失，有的甚至塌陷成残渣(图4C)。在用鼠李糖乳杆菌GG处理的幽门螺杆菌细胞中也发现了类似的形态学变化(图4E)。通过透射电镜评估，未处理的幽门螺杆菌细胞似乎具有完整的细胞壁和致密的细胞质。此外，在细胞壁和细胞质之间观察到明显的边界(图4A)。显然，植物乳杆菌ZJ(革兰氏阳性菌)和鼠李糖乳杆菌GG(革兰氏阳性菌)的细胞壁比幽门螺杆菌(革兰氏阴性菌)的细胞壁厚得多。用乳酸杆菌菌株处理的幽门螺杆菌的细胞壁和细胞膜凹陷且不完整，细胞质内容物从膜中漏出(图4C′，E′)。然而，植物乳杆菌ZJ和鼠李糖乳杆菌GG的细胞形态不受幽门螺杆菌的影响(图4B′，D′)。

5.对胃组织病理学的影响

图5苏木精-伊红染色不同组胃组织标本的病理照片。预防组:(A)NC组，(B)ZJ组，(C)LGG组，(D)HP组，(E)ZJ+HP组，(F)LGG+HP组。治疗组:(G)NC组，(H)HP组，(I)HP+ANT组，(J)HP+ZJ组，(K)HP+LGG组。黑色箭头，液泡状细胞质；红色箭头，炎性细胞浸润；绿色箭头，浆膜出血。

图5显示了从属于不同组的小鼠获得的胃组织切片的苏木精-伊红染色结果。预防试验组NC和治疗试验组ZJ、LGG和NC(图5AC、G)粘膜结构清晰，上皮完整，粘膜腺排列紧密，形态正常，无明显炎症反应。在属于幽门螺杆菌预防组的小鼠中，腺上皮细胞有少量肿胀，在局部粘膜层和粘膜下层有空泡状细胞质(黑色箭头)和更多炎性细胞浸润(红色箭头)(图5D)。用植物乳杆菌ZJ预处理的小鼠(ZJ+幽门螺杆菌组)的粘膜下炎症细胞显著减少(图5E)。与预防组幽门螺杆菌(图5D)相比，治疗组幽门螺杆菌感染模型(图5H)出现浆膜出血(绿色箭头)。抗生素治疗可以在10天后恢复胃粘膜组织损伤(图5I)。口服植物乳杆菌ZJ(HP+ZJ组)和鼠李糖乳杆菌GG(HP+LGG组)后，粘膜下炎性细胞明显减少，浆膜出血消失；然而，在胃组织的病理切片中仍然存在轻微的炎性细胞浸润(红色箭头)(图5J，K)。可以证明，植物乳杆菌ZJ的胃内给药可以作为对幽门螺杆菌感染引起的炎症反应的辅助治疗和预防措施。

6.对胃粘膜炎症细胞因子的影响

图6RT-qPCR检测各组胃组织中炎性细胞因子mRNA表达水平。(A?D)IFN-γ、IL-6、IL-1β和IL-10分别在预防组中。(E?H)IFN-γ、IL-6、IL-1β和IL-10分别在治疗组中。

胃粘膜中基因表达水平的分析表明，幽门螺杆菌感染和乳酸杆菌给药显著改变了炎症反应(图6)。仅在植物乳杆菌ZJ和鼠李糖乳杆菌GG给药后，IFN-γ、IL-6和IL-1β水平有所升高(图6AC)，可能是由于胃内给药操作不当，可能导致了某些损伤。植物乳杆菌ZJ有助于抗炎细胞因子IL-10水平的显著增加(p0.05)，而鼠李糖乳杆菌GG没有(图6D)。在感染幽门螺杆菌的小鼠中，干扰素-γ、白细胞介素-1β和白细胞介素-6水平显著升高(p0.)(图6AC，E-G)，而白细胞介素-10水平降低(p0.05)(图6D，H)。与幽门螺杆菌感染组相比，在预防组中使用植物乳杆菌ZJ和鼠李糖乳杆菌GG导致结肠IFN-γ(p0.01)和IL-6(p0.05)水平显著降低(图6A，B)，但几乎不影响IL-1β(图6C)。白细胞介素-10的基因水平在两个乳酸杆菌组中均显著升高(p0.05)(图6D)。

抗生素给药对幽门螺杆菌感染有显著的治疗作用，这反映在炎症因子IFN-γ(p0.)、IL-6(p0.01)和IL-1β(p0.05)水平的显著降低(图6E-G)。植物乳杆菌ZJ治疗组受感染结肠组织中IFN-γ(p0.01)和IL-6(p0.05)水平呈显著下降趋势(图6E，F)。然而，在鼠李糖乳杆菌GG处理的小鼠和感染的小鼠之间没有观察到白介素-6和白介素-1β水平的显著变化(图6F，G)。此外，仅通过连续给予植物乳杆菌ZJ，白介素-10水平的表达增加(p0.05)(图6H)。

7.使用乳酸菌预防幽门螺杆菌感染后的细菌分类

图7预防组胃细菌群落组成及丰度。(A)通过LEfSe在预防组的胃微生物群中显著区分细菌分类群。(B)LEfSe揭示了植物乳杆菌ZJ(绿色)和鼠李糖GG(红色)预防组的微生物群落丰度显著不同。(B)螺杆菌属水平相对丰度的变化。

预防组的胃细菌群落组成如图7A所示。在提到的13个细菌门中，3个占优势(按降序排列：厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门)，厚壁菌门和拟杆菌门平均占每个样本OTU的87.23%。幽门螺杆菌感染组中有22个细菌类群(如巴斯德氏菌科、普氏菌科、紫菜科、臭萜科、真杆菌科、梭状芽孢杆菌科、根瘤菌科和幽门螺杆菌科)显著丰富(p0.05)。在接受植物乳杆菌ZJ的小鼠中，德哈氏菌科和地革菌科的丰度增加(p0.05)。鼠李糖乳杆菌GG预防组中皮肤乳头瘤病毒科、乳球菌科和鞘翅目的丰度增加(p0.05)(图7B)。为了确定乳酸杆菌对幽门螺杆菌感染的预防作用，通过LEfSe在属水平上比较了预防组中胃微生物群中幽门螺杆菌的相对丰度(图7C)。在NC组和仅灌胃植物乳杆菌ZJ和鼠李糖乳杆菌GG的组中，小鼠胃中的幽门螺杆菌浓度极低。幽门螺杆菌在幽门螺杆菌感染组的患病率普遍较高，平均相对丰度为8.76±1.62%。由于植物乳杆菌ZJ的预防作用，幽门螺杆菌的平均相对丰度显著降低至仅5.46±0.82%(p0.01)。相反，幽门螺杆菌的胃定殖能力不受使用鼠李糖乳杆菌GG预防的影响，幽门螺杆菌显示平均相对丰度为7.18±1.13%。微生物组成和丰度的变化表明，使用植物乳杆菌ZJ进行预防可以减少幽门螺杆菌感染，从而减少胃中有害微生物的生长。

8.幽门螺杆菌感染后乳酸菌治疗后的细菌分类

图8治疗组的胃细菌群落组成和丰度。(A)通过LEfSe在治疗组的胃微生物群中显著分化的细菌分类群。(B)螺杆菌属水平相对丰度的变化。(C)LEfSe显示植物乳杆菌ZJ(红色)、鼠李糖乳杆菌GG(绿色)和抗生素(紫色)处理组中具有显著不同丰度的微生物群。

经过4周的乳酸杆菌处理后，通过LEfSe分析小鼠胃中细菌组成和螺杆菌属水平相对丰度的变化，如图8所示。厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门在13个细菌门中仍然占优势，厚壁菌门和拟杆菌门平均占每个样本OTU的84.21%。幽门螺杆菌感染组中，幽门螺杆菌科、乳球菌科、前幽门螺杆菌科、贫血科、梭菌科、除铁萜科、去海杆菌科、鞘氨醇杆菌科和加臭萜科的患病率显著增加(p0.05)(图8A)。与正常组相比，感染后小鼠胃中螺杆菌属的平均相对丰度增加到11.35±1.35%(图8B)。用植物乳杆菌ZJ处理显著促进了益生菌的生长，如小鼠胃粘膜中属于乳杆菌科(乳杆菌属)和放线菌科(玫瑰菌属)的益生菌，并降低了病原菌的丰度，如普雷沃氏菌和螺杆菌属(图8B，C)。此外，用植物乳杆菌ZJ灌胃降低了大多数小鼠胃中幽门螺杆菌的丰度；而鼠李糖乳杆菌的作用不明显，提示植物乳杆菌ZJ具有保护胃微生态环境的作用。虽然抗生素治疗可以显著降低幽门螺杆菌至正常水平，约为1.61±1.50%，但属于拟杆菌科、肠杆菌科、丹毒杆菌科、气球菌科和伯克霍尔德氏菌科的细菌的流行率显著增加(图8C)。

●结论

本研究评估了植物乳杆菌ZJ在模拟胃肠耐受性、自动聚集和共聚集活性以及体外抗幽门螺杆菌和抗脲酶特性方面的益生菌特性。植物乳杆菌ZJ通过预防胃粘膜炎症和调节小鼠感染模型中的胃微生物群来减少幽门螺杆菌的定居。口服益生菌可能是预防和治疗幽门螺杆菌感染的替代策略。然而，这种方法需要通过临床应用进一步验证。

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